Enteropatógenos

El Laboratorio Nacional de Referencia de Enteropatógenos es referente para el diagnóstico y tipificación de diversos patógenos bacterianos emergentes, realiza investigación y transferencia de nuevas tecnologías para la confirmación y sub-tipificación genética para la prevención y control de las enfermedades causadas por Enteropatógenos.

Dentro de las responsabilidades del laboratorio incluyen la referencia y diagnóstico confirmatorio de pruebas microbiológicas y moleculares (PCR convencional, qPCR y PFGE), transferencia tecnológica, vigilancia de la resistencia antimicrobiana, la evaluación y control de la calidad del diagnóstico de Enteropatógenos bacterianos, además, el laboratorio forma parte de la Red Nacional de Laboratorios y participa activamente en proyectos de investigación y colaboraciones en un ámbito nacional e internacional.

La experiencia de los profesionales del laboratorio permitió aislar el agente causal del Cólera, Vibrio cholerae serogrupo O1 Inaba Biotipo El Tor causante de la séptima pandemia, cuya extensión llego al continente americano a través de las costas peruanas en el año 1991. 
Finalmente, el laboratorio viene implementando el estudio del WGS (Whole Genome Sequencing) de patógenos como Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus y Salmonella Infantis multiresistente, mediante el Secuenciamiento de próxima generación (NGS – Next Generation Sequencing), con el soporte de la tecnología Illumina Inc., además del uso de servidores de alta capacidad computacional para el análisis bioinformático usando Pipeline’s y softwares de análisis de data genómica. 

Responsable del Laboratorio: Dr. Ronnie Gustavo Gavilan Chavez 
Correo: rgavilan@ins.gob         
Teléfono: 01-7481111 anexo: 2117

1. Pruebas de diagnóstico realizadas en el LANARE
2. Vigilancia basada en laboratorio
3. Investigaciones en Salud Púbica
4. Publicaciones Científicas
5. Actualidad
6. Transferencia tecnológicas
7. Programa de Evaluación Externa de Calidad
8. Indicadores de diagnóstico
9. Eventos (Cursos, Talleres)
10. Colaboradores científicos
11. Galería fotográfica – científica

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1. Pruebas de diagnóstico realizadas en el LANARE

Confirmación del diagnóstico Microbiológico de:

• Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Campylobacter spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas spp., Plesiomonas shigelloides, Yersinia enterocolítica y otras Enterobacterias.

Serotipificación:

• Salmonella spp., Shigella spp. y Vibrio cholerae.

Sensibilidad Antimicrobiana:

• Pruebas de sensibilidad antimicrobiana a enteropatógenos mediante el método de Kyrbi Bauer (Disco Difusión). Pruebas de epsilometría para Campylobacter.

Pruebas moleculares:

• PCR para la caracterización molecular de Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Campylobacter spp, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus.
• PFGE: Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus.
• Whole genome sequencing (WGS) de Enteropatógenos de importancia en Salud Pública basado en NGS (Illumina Inc.).

 

2. Vigilancia basada en laboratorio

• Vigilancia Molecular de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus en la costa peruana de Tumbes, Piura, Lambayeque y La Libertad en el periodo 2018.
• Vigilancia integrada de la resistencia antimicrobiana de bacterias patógenas de relevancia en Salud Publica.

3. Investigaciones en Salud Púbica

En la actualidad el Laboratorio viene desarrollando proyectos de investigación, financiados por el Instituto Nacional de Salud y Concytec a través de Cienciactiva/FONDECYT. Entre los cuales tenemos:

• Proyecto de Investigación: “Depuración de metales pesados en poblaciones con exposición crónica mediante la utilización de bacterias probióticas”, financiado por FONDECYT - Grand Challenges Canadá.
• Proyecto de Investigación: “Desarrollo de plataformas para el diagnóstico y vigilancia molecular de infecciones que cursan con síndrome febril y síndrome diarreico agudos”, Financiado por: Instituto Nacional de Salud.
• Proyecto de Investigación: “Impacto del Evento del Niño en la estacionalidad de las enfermedades diarreicas causadas por especies patógenas de Vibrio en Perú”, financiado por: Cienciactiva/FONDECYT.
• Proyecto de Investigación: “Epidemiología molecular genética de la Salmonelosis Multirresistente”, financiado por: Cienciactiva/FONDECYT.
• Proyecto de Investigación: “Factores asociados a la Anemia en recién nacidos y niños de 3, 6, 9, 12 meses de vida atendidos en establecimientos de salud del Minsa en Iquitos y Huancavelica”, financiado por INS - PPR/PAN (Colaborativo).

4. Publicaciones Científicas

Investigación científica en genómica microbiana con énfasis en Enteropatógenos de importancia en Salud Publica:

1. Atencio, L. A., Dal Grande, F., Young, G. O., Gavilán, R., Guzmán, H. M., Schmitt, I., Mejía, LC. y Gutiérrez, M. (2018). Antimicrobial‐producing Pseudoalteromonas from the marine environment of Panama shows a high phylogenetic diversity and clonal structure. Journal of basic microbiology.
2. Tello CA, Borja N, Gavilan RG, García-de-la-Guarda R. Multiplex PCR assay for genotyping of Mycobacterium tuberculosis in Lima, Peru. Rev Argent Microbiol. 2017. 49(3):298-300. 
3. Wang M, Carver JJ, Phelan VV, Sanchez LM, Garg N, Peng Y, Nguyen DD, Watrous J, Kapono CA, Luzzatto-Knaan T, Porto C, Bouslimani A, Melnik AV, Meehan MJ, Liu WT, Crüsemann M, Boudreau PD, Esquenazi E, Sandoval-Calderón M, Kersten RD, Pace LA, Quinn RA, Duncan KR, Hsu CC, Floros DJ, Gavilan RG, et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nat Biotechnol. 2016. 34(8):828-837. 
4. Gonzalez-Escalona N, Gavilan RG, Toro M, Zamudio ML, Martinez-Urtaza J. Outbreak of Vibrio parahaemolyticus Sequence Type 120, Peru, 2009. Emerg Infect. Dis. 2016 Jul; 22(7):1235-7.
5. Kikvidze Z, Brooker RW, Butterfield BJ, Callaway RM, Cavieres LA, Cook BJ, Lortie CJ, Michalet R, Pugnaire FI, Xiao S, Anthelme F, Björk RG, Cranston BH, Gavilan RG, Kanka R, Lingua E, Maalouf JP, Noroozi J, Parajuli R, Phoenix GK, Reid A, Ridenour WM, Rixen C, Schöb C. The effects of foundation species on community assembly: a global study on alpine cushion plant communities. Ecology. 2015. 96(8):2064-9. 
6. González-Escalona N, Gavilan RG, Brown EW, Martinez-Urtaza J. Transoceanic spreading of pathogenic strains of Vibrio parahaemolyticus with distinctive genetic signatures in the recA gene. PLoS One. 2015. 10(2):e0117485. 
7. Moree WJ, McConnell OJ, Nguyen DD, Sanchez LM, Yang YL, Zhao X, Liu WT, Boudreau PD, Srinivasan J, Atencio L, Ballesteros J, Gavilán RG, Torres-Mendoza D, Guzmán HM, Gerwick WH, Gutiérrez M, Dorrestein PC. Microbiota of healthy corals are active against fungi in a light-dependent manner. ACS Chem. Biol. 2014. 9(10):2300-8. 
8. Rosas S, Bravo J, Gonzalez F, de Moreno N, Sanchez J, Gavilan RG, Goodridge A. High clustering rates of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis genotypes in Panama. BMC Infect Dis. 2013. 13:442.
9. Moree WJ, Yang JY, Zhao X, Liu WT, Aparicio M, Atencio L, Ballesteros J,Sánchez J, Gavilán RG, Gutiérrez M, Dorrestein PC. Imaging mass spectrometry of a coral microbe interaction with fungi. J Chem Ecol. 2013. 39(7):1045-54. 
10. Nguyen DD, Wu CH, Moree WJ, Lamsa A, Medema MH, Zhao X, Gavilan RG, AparicioM, Atencio L, Jackson C, Ballesteros J, Sanchez J, Watrous JD, Phelan VV, Van de Wiel C, Kersten RD, Mehnaz S, De Mot R, Shank EA, Charusanti P, Nagarajan H, Duggan BM, Moore BS, Bandeira N, Palsson BØ, Pogliano K, Gutiérrez M, Dorrestein PC. MS/MS networking guided analysis of molecule and gene cluster families. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013. 110(28):E2611-20. 
11. Gavilan RG, Zamudio ML, Martinez-Urtaza J. Molecular epidemiology and genetic variation of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in Peru. PLoS Negl Trop Dis. 2013. 7(5):e2210. 

5. Actualidad

En el presente año 2018 el Laboratorio Nacional de Referencia de Enteropatógenos viene implementando nuevos métodos moleculares basados en el  desarrollo de: 

• qPCR Pentaplex para el diagnóstico de 5 patógenos causantes de EDAs (Salmonella, Campylobacter, Shigella, E. coli y Vibrio).
• qPCR Multiplex para la detección de Campylobacter jejuni y Campylobacter coli.
• PCR convencional para detección del gen de la Toxina Colérica de Vibrio cholerae (ctxA).
• Método LAMP para detección de la toxina colérica de Vibrio cholerae (ctxA).
• Método LAMP para la detección de Vibrio parahaemolyticus (toxR/tdh/trh).
• PCR Multiplex para la detección de Vibrio cholerae toxigénica (Vc-m, ctxA y tcpA).
• qPCR Multiplex para la detección de Vibrio parahaemolyticus (toxR/tdh/trh).
• PCR convencional para la tipificación de Vibrio parahaemolyticus).
• PCR convencional para detección de Betalactamasas de espectro extendido (blaCTX-M).
• El laboratorio de Enteropatógenos viene implementando el diagnóstico mediante el análisis de microarreglos (Microarrays) con chips de ADN por colorimetría para el proyecto “Desarrollo de plataformas para el diagnóstico molecular de infecciones que cursan con síndrome febril agudo y síndrome diarreico agudo”.

6. Transferencia tecnológicas

• Desarrollo de la Transferencia de métodos de laboratorio a las regiones de Piura, Tumbes, Ica; La Libertad y Callao: Transferencia Cultivo para identificación de Salmonella spp, y Shigella spp., Escherichia coli y Cultivo y tipificación de Vibrio cholerae.

7. Programa de Evaluación Externa de Calidad

• PEEC - Control de Calidad Internacional, Global Foodborne Infections Network (GFN), EQAS-WHO.
• PEED - Programa de Evaluación Externa del Desempeño del Laboratorio de Enteropatógenos.

8. Indicadores de diagnóstico

• 1628 cepas de Enteropatógenos evaluadas y tipificadas durante el 2017 (Sistema Netlab).

9. Eventos(Cursos, Talleres)

• Curso Internacional: “Epidemiología, Ecología y Genómica del Cólera”.
• Curso taller: “Análisis Bioinformático de genomas bacterianos”.
• Jornada Internacional: “Análisis computacional de genomas microbianos”.
• Curso Pre Congreso INS: ”Actualización en el diagnóstico de Cólera y en enfermedades diarreicas”.

 

10. Colaboradores científicos

	Dr. Jaime Martínez Urtaza. Científico senior del Centre for Environment, Fisheries and Aquaculture Science (CEFAS) en el Reino Unido. Su trabajo abarca diferentes aspectos de la Epidemiología Molecular y los efectos del clima en las enfermedades infecciosas. Sus intereses de investigación se han centrado principalmente en el estudio de enfermedades transmitidas por alimentos y agua y, en particular, el uso de herramientas genómicas avanzadas para investigar la distribución y la epidemiología de patógenos humanos y rastrear las principales vías de diseminación de patógenos y enfermedades.
	Dr. Michel Abanto Marín. Maestría en Biología Molecular por la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Doctorado por el Programa de Postgrado en Biología Computacional y Sistemas del Instituto Oswaldo Cruz / FIOCRUZ. Tiene experiencia en el área de genética molecular de microorganismos, Genómica comparativa y Bioinformática. Universidad de La Frontera · BIOREN-UFRO.
	Dr. González-Escalona. Microbiólogo de Investigación en la Oficina de Ciencia Reguladora (ORS), división de Microbiología, rama de métodos moleculares y subtipificación, en el Centro de Seguridad Alimentaria y Nutrición Aplicada, FDA, en College Park, MD. Ha estado trabajando en SRO desarrollando nuevos métodos (qPCR) para detectar Salmonella Enteritidis en productos de huevo. Desarrolla métodos alternativos para la subtipación de Salmonella, incluida la genómica, MLST del genoma completo. Su investigación incluye la Ecología y la evolución de las bacterias marinas, especialmente el género Vibrio. Trabaja en la genómica de la evolución de los patógenos transmitidos por los alimentos, el seguimiento de fuentes, la resistencia a los antibióticos, etc. Es curador del sitio web de MLST para V. parahaemolyticus. Recibió su doctorado de la Universidad de Chile en 2004 y completó más estudios postdoctorales en el Gulf Coast Seafood Laboratory (GCSL), FDA, Dauphin Island, AL.
	Dr. Mitsuaki Nishibuchi. Investigador y profesor de la Facultad de Medicina del Centro de Estudios del Sudeste Asiático, División de Humanos y Medio Ambiente, Life Environment, Kyoto. Destacó como investigador asociado postdoctoral en Genética Bacteriana, Centro para el Desarrollo de Vacunas, Universidad de Maryland, EE.UU. Su principal interés son las infecciones entéricas en Asia. Sus publicaciones más importantes incluyen Nishibuchi, M. 2004. La infección por un nuevo clon de Vibrio parahaemolyticus: una enfermedad infecciosa que surgió en Asia y se extendió a una pandemia mundial. Las especies de Vibrio. Microbiología y Biología Molecular: En P. M. y A. K. Fratamico Bhunia (ed), patógenos transmitidas por los alimentos. Horizonte Prensa Científica, Norfolk, U. K. pp. 251-271. nisibuti@cseas.kyoto-u.ac.jp

 

11. Galería fotográfica – científica

Figura 1. Miembros del Laboratorio de Referencia Nacional de Enteropatógenos.

 

Figura 2. Resultado del porcentaje de concordancia inter-laboratorio del PEED Laboratorio de Enteropatógenos 2014.

 

Figura 3. Flujograma de trabajo para la detección de V. cholerae y V. parahaemolyticus mediante LAMP-PCR a partir de muestras ambientales y alimentos marinos.

 

Figura 4. Comparación de genomas de cepas de Vibrio parahaemolyticus O4:K8 causantes de brotes epidémicos en Perú y países Asiáticos.

 

Figura 5. Árbol de mínima expansión de Vibrio parahaemolyticus ambiental y clínico aislados de Perú usando 266 genomas, secuenciados y analizados en el Laboratorio Nacional de Referencia de Enteropatógenos. En la gráfica se observa las relaciones genéticas de las cepas agrupados por ST (Sequence Type) y por su procedencia clínica y/o ambiental. Para el resultado final su usaron las herramientas bioinformáticas: A5 pipeline, Parsnp, RAxML, para visualizar la gráfica se utilizó GrapeTree.

 

Figura 6. Genómica de Salmonella infantis aislados, secuenciados y analizados en el Laboratorio Nacional de Referencia de Enteropatógenos. Para el resultado final se usaron las siguientes herramientas bioinformáticas (A5 pipeline y PopPunk) y se visualizó en MicroReact.

 

Figura 7. Flujograma de trabajo para el análisis de Microarrays para el diagnóstico molecular de SFA y SDA en el Laboratorio de Enteropatógenos.

 

Figura 8. Impresión de prueba de titulación con 5 oligos en réplicas de 5 (izquierda).  Impresión de Titulación del control positivo de referencia en réplicas de 30 (derecha). Ambos ensayos marcados con sciCOLOR T2, obtenidos en una lectora de Microarrays. SCIENION US (Tempe, AZ, EE. UU.).

 

Figura 8. (Izquierda) Mapa oceanográfico donde se observa el aumento de la temperatura del Mar en la costa norte peruana (Fuente: National Oceanic and Atmospheric Administration (NOAA-U.S. Department of Commerce). (Derecha) Ubicación geográfica de los brotes de Vibrio cholera y V. parahaemolyticus en la costa norte peruanaentre los años 90 y 97.

 

Figura 9. Dendograma obtenido de lecturas de Electrophoresis en Campo Pulsado (PFGE) a partir de cepas de Vibrio parahaemolyticus aislados de Piura, Lambayeque, Cajamarca, Loreto y Lima. Se observa la presencia de un nuevo clon pandémico (Sequence Type – ST 120), en el brote del año 2009 en Piura.

 

Figura 10. El ensayo PCR en tiempo real múltiple, identificó de manera específica y diferencial a 5 patógenos asociados al Sindrome Febril.

 

Figura 11. El ensayo LAMP identificó de manera específica al virus Zika.